Токсоплазма доставит терапевтические белки к нейронам – несмотря на препятствия гематоэнцефалического барьера

Доставка белков в органы мишеней – сложная задача, поскольку белки часто нестабильны вне клетки, а также, попадая в организм, могут вызвать нежелательные иммунные реакции. Кроме того, разные биологические барьеры препятствуют свободному прохождению через них молекул. Так, чтобы проникнуть в ЦНС, белки должны пройти через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), но это почти невозможно, поскольку белки — большие, а часто и гидрофильные молекулы, поэтому ГЭБ для них неприступное препятствие. Чтобы преодолеть ограничения ГЭБ, используются разные носители — наночастицы, липосомы, экзосомы, однако эти транспортные средства подходят в основном для пептидов, а не к полноразмерным протеинам.

Международная команда нейробиологов решила использовать для доставки цельных белков к нейронам внутриклеточного паразита — Toxoplasma gondii. Токсоплазма легко проникает через гематоэнцефалический барьер и заражает нейроны. Кроме того, у нее есть органоиды, секретирующие белки — роптрия и плотные гранулы. Сначала исследователи сшили гены нескольких белков, имеющих терапевтический потенциал для лечения неврологических заболеваний человека, с секретируемыми токсоплазмой генами белков. Для секреции белков через роптрии ученые сшивали терапевтические белки с токсофиллином, а для доставки через плотные гранулы – с протеином GRA16, получив в результате гибридные белки.

Экспериментально подтверждено

Затем ученые проверили наличие этих белков в органеллах паразита (роптриях и плотных гранулах), а также в цитозоле хозяина. 3 из 11 протестированных белков, сшитых с токсофиллином, локализованы в роптриях — CDNF, PARK2 и TFEB. Однако выявить эти белки в клетках-мишенях не удалось, несмотря на то, что белки из раптрий попадают непосредственно в клетку-мишень – это означало, что уровень секреции или активность гибридных белков были недостаточными.

Белки, секретируемые плотными гранулами, сначала попадают в паразитофорную вакуоль, а затем должны преодолеть мембрану этой вакуоли. Три из девяти гибридных белков локализуются внутри этой вакуоли, но не в клетке мишени. Еще три ядерных белка, SMN1, TFEB и MeCP2, сшиты из GRA16, локализованы как внутри вакуоли, так и в ядре клетки-хозяина. Молекулярная этих гибридных белков варьировала от 88 до 110 кДа, то есть они были достаточно большими. Наиболее надежную доставку показали TFEB и MeCP2, поэтому учёные сосредоточились на них. Анализ кинетики инфекции и доставки белка показал, что через сутки после заражения от 50 до 62 процентов дермальных фибробластов человека было инфицировано токсоплазмой, и у 73-86% из них выявляли белки GRA16, GRA16-MeCP2 и GRA16-TF. Ядерные уровни гибридных белков были в восемь раз ниже уровня одного GRA16, то есть количество доставленных гибридных белков было ниже количества доставленного белка паразита.

Далее учёные инфицировали токсоплазмой культур зрелых дофаминергических нейронов человека и продемонстрировали, что GRA16-MeCP2 и GRA16-TFEB успешно доставляется и в эти клетки. Через сутки после инокуляции уровень MeCP2 в нейронах с нокаутом гена MECP2 достигал 58 процентов уровней MeCP2 в нейронах дикого типа. Эти значения сравнимы с уровнями белка, достигнутыми в предыдущих исследованиях на моделях синдрома Ретта. Далее ученые заразили инженерной токсоплазмой первичные нейроны мышей и клетки нейробластомы мышей, и продемонстрировали, что GRA16-MeCP2 связывает гетерохроматин в ядрах, подобно функциональному эндогенному MeCP2. Также с помощью аффинной адсорбции исследователи показали, что GRA16-MeCP2, доставляемый с помощью токсоплазмы, специфически связывает метилированную ДНК, подобно эндогенному человеческому MeCP2.

На органоидах коры мозга человека было продемонстрировано, что доставка белка GRA16-MeCP2 с помощью токсоплазмы изменяет транскриптомные профили нейронов, хотя и не слишком выражена. В нейронах, инфицированных Toxoplasma gondii, несущей GRA16-MeCP2, несколько усилилась регуляция гена CREB1 и снизилась регуляция MEF2C. В заключение авторы сконструировали новые линии Toxoplasma gondii, используя штамм с низкой вирулентностью, и ввели их мышам внутрибрюшно. Последующий анализ срезов мозга этих мышей подтвердил локализацию GRA16-MeCP2 в ядрах нейронов.

По мнению авторов работы, полученные результаты свидетельствуют о том, что Toxoplasma gondii можно использовать для доставки белков к клеткам в опытных и терапевтических целях. Однако эту систему доставки еще предстоит улучшить, прежде всего, разработать ослабленные штаммы токсоплазмы, чтобы улучшить профиль безопасности паразитарных векторов.