Токсоплазма доставляє терапевтичні білки до нейронів – попри перешкоди гематоенцефалічного бар’єру

Доставка білків до органів мішеней — складне завдання, оскільки білки часто нестабільні поза клітиною, а також, потрапляючи в організм, можуть викликати небажані імунні реакції. Крім того, різні біологічні барʼєри перешкоджають вільному проходженню через них молекул. Так, щоб проникнути в центральну нервову систему, білки повинні пройти через гематоенцефалічний барʼєр (ГЕБ), але це майже неможливо, оскільки білки — великі, а часто й гідрофільні молекули, тому ГЕБ для них неприступна перешкода. Щоб подолати обмеження ГЕБ, використовуються різні носії — наночастки, ліпосоми, екзосоми, проте ці транспортні засоби підходять здебільшого для пептидів, а не до повнорозмірних протеїнів.

Міжнародна команда нейробіологів вирішила використати для доставки цілісних білків до нейронів внутрішньоклітинного паразита — Toxoplasma gondii. Токсоплазма легко проникає через гематоенцефалічний барʼєр і заражає нейрони. Крім того, у неї є органели, що секретують білки — роптрію та щільні гранули. Спочатку дослідники пошили гени кількох білків, що мають терапевтичний потенціал для лікування неврологічних захворювань людини, з генами білків, що секретуються токсоплазмою. Для секреції білків через роптрії вчені зшивали терапевтичні білки з токсофіліном, а для доставки через щільні гранули — з протеїном GRA16, отримавши результаті гібридні білки.

Експериментально підтверджено

Потім вчені перевірили наявність цих білків у органелах паразита (роптріях та щільних гранулах), а також у цитозолі господаря. 3 з 11 протестованих білків, зшитих з токсофіліном, локалізовані в роптріях — CDNF, PARK2 і TFEB. Однак виявити ці білки в клітинах-мішенях не вдалося, попри те, що білки з роптрій потрапляють безпосередньо в клітину-мішень – це означало, що рівень секреції чи активність гібридних білків були недостатніми.

Білки, що секретуються щільними гранулами, спочатку потрапляють у паразитофорну вакуолю, а потім повинні подолати мембрану цієї вакуолі. Три з девʼяти гібридних білків локалізувалися всередині цієї вакуолі, але не в клітині мішені. Ще три ядерні білки, SMN1, TFEB і MeCP2, зшиті з GRA16, локалізовані як усередині вакуолі, так і в ядрі клітини-господаря. Молекулярна цих гібридних білків варіювала від 88 до 110 кДа, тобто вони були досить великими. Найбільш надійну доставку показали TFEB і MeCP2, тому вчені зосередилися на них. Аналіз кінетики інфекції та доставки білка показав, що через добу після зараження від 50 до 62 відсотків дермальних фібробластів людини було інфіковано токсоплазмою, і в 73–86% з них виявляли білки GRA16, GRA16-MeCP2 та GRA16-TF. Ядерні рівні гібридних білків були у вісім разів нижчими за рівні одного GRA16, тобто кількість доставлених гібридних білків була нижчою, ніж кількість доставленого білка паразита.

Далі науковці інфікували токсоплазмою культур зрілих дофамінергічних нейронів людини і продемонстрували, що GRA16-MeCP2 і GRA16-TFEB успішно доставляється і в ці клітини. Через добу після інокуляції рівень MeCP2 у нейронах з нокаутом гена MECP2 досягав 58 відсотків від рівнів MeCP2 у нейронах дикого типу. Ці значення були порівняні з рівнями білка, досягнутими у попередніх дослідженнях на моделях синдрому Ретта. Далі вчені заразили інженерною токсоплазмою первинні нейрони мишей і клітини нейробластоми мишей, і продемонстрували, що GRA16-MeCP2 повʼязує гетерохроматин у ядрах, подібно до функціонального ендогенного MeCP2. Також за допомогою афінної адсорбції дослідники показали, що GRA16-MeCP2, який доставляється за допомогою токсоплазми, специфічно звʼязує метильовану ДНК, подібно до ендогенного людського MeCP2.

На органоїдах кори мозку людини було продемонстровано, що доставка білка GRA16-MeCP2 за допомогою токсоплазми змінює транскриптомні профілі нейронів, хоча і не надто виражено. В нейронах, інфікованих Toxoplasma gondii, що несе GRA16-MeCP2, трохи посилилася регуляція гена CREB1 і знизилася регуляція MEF2C. Насамкінець автори сконструювали нові лінії Toxoplasma gondii, використовуючи штам з низькою вірулентністю, і ввели їх мишам внутрішньочеревно. Подальший аналіз зрізів мозку цих мишей підтвердив локалізацію GRA16-MeCP2 у ядрах нейронів.

На думку авторів роботи, отримані результати свідчать про те, що Toxoplasma gondii можна використовувати для доставки білків до клітин в дослідних та терапевтичних цілях. Однак цю систему доставки ще потрібно покращити, передусім, розробити ослаблені штами токсоплазми, щоб покращити профіль безпеки паразитарних векторів.